L’hybridation in situ est une technique puissante utilisée
pour visualiser les ARN messagers dans les tissus et les cellules, permettant
ainsi une analyse spatiale et temporelle de l’expression des gènes
dans les tissus animaux et végétaux. C’est une étape
clé de l’analyse fonctionnelle des gènes.
Elle consiste à créer des liaisons hydrogènes entre
les bases azotées de la séquence d’un acide nucléique
portant un marqueur (une sonde) et la séquence complémentaire
présente dans les tissus, générant ainsi un signal
détectable au microscope.
Il s’agit d’une technique longue et délicate. L’équipe
PHIV possède une longue expérience en hybridation
in situ acquise sur une grande diversité d’organes
et d’espèces (sur les plantes modèles Arabidopsis
thaliana, Medicago truncatula, Oriza sativa mais aussi sur des
espèces tropicales, cacaoyer, palmier,hévéa etc…)
et sur différents types de gènes (gènes faiblement
exprimés, facteurs de transcription, transporteurs d’ions…)
Les différentes étapes de l’expérience (préparation
des échantillons, coupes, synthèse et marquage des sondes,
hybridation proprement dite et observations au microscope) sont délicates
et difficiles à standardiser. Fort de notre expérience,
nous proposons plusieurs protocoles afin de s’adapter aux tissus
et aux gènes étudiés dans la plante. Ces adaptations
portent autant sur la préparation des échantillons et
la synthèse des sondes que sur les conditions d’hybridation
et la révélation du signal. Nous proposons notamment,
dans certains cas, une révélation en fluorescence (grâce
à des anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome)
afin d’augmenter la précision du signal obtenu.
L’acquisition des images est alors réalisée en microscopie
à épifluorescence ou confocale avec analyse spectrale
afin de s’affranchir de l’autofluorescence des tissus (parois,
composés phénoliques, etc…) et de valider le signal
obtenu.
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