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Hybridation in situ

L’hybridation in situ est une technique puissante utilisée pour visualiser les ARN messagers dans les tissus et les cellules, permettant ainsi une analyse spatiale et temporelle de l’expression des gènes dans les tissus animaux et végétaux. C’est une étape clé de l’analyse fonctionnelle des gènes.
Elle consiste à créer des liaisons hydrogènes entre les bases azotées de la séquence d’un acide nucléique portant un marqueur (une sonde) et la séquence complémentaire présente dans les tissus, générant ainsi un signal détectable au microscope.

Il s’agit d’une technique longue et délicate. L’équipe PHIV possède une longue expérience en hybridation in situ acquise sur une grande diversité d’organes et d’espèces (sur les plantes modèles Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula, Oriza sativa mais aussi sur des espèces tropicales, cacaoyer, palmier,hévéa etc…) et sur différents types de gènes (gènes faiblement exprimés, facteurs de transcription, transporteurs d’ions…)
Les différentes étapes de l’expérience (préparation des échantillons, coupes, synthèse et marquage des sondes, hybridation proprement dite et observations au microscope) sont délicates et difficiles à standardiser. Fort de notre expérience, nous proposons plusieurs protocoles afin de s’adapter aux tissus et aux gènes étudiés dans la plante. Ces adaptations portent autant sur la préparation des échantillons et la synthèse des sondes que sur les conditions d’hybridation et la révélation du signal. Nous proposons notamment, dans certains cas, une révélation en fluorescence (grâce à des anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome) afin d’augmenter la précision du signal obtenu.
L’acquisition des images est alors réalisée en microscopie à épifluorescence ou confocale avec analyse spectrale afin de s’affranchir de l’autofluorescence des tissus (parois, composés phénoliques, etc…) et de valider le signal obtenu.

Localisation d'ARN messagers de ferritine par HIS dans une feuille d'Arabidopsis thaliana (Alexa 488)

 

AtFer1

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Témoin positif

Déconvolution spectrale