Immunolocalisation de protéines végétales

La plateforme PHIV propose une technique dite indirecte, le marqueur (enzyme ou fluorochrome) étant conjugué à un anticorps secondaire et a développé plusieurs protocoles afin de s’adapter à la grande diversité des tissus végétaux. Ces protocoles peuvent être utilisés sur des échantillons inclus en paraffine ou en résine, ou sur des tissus frais.
Les adaptations réalisées portent sur la préparation des échantillons, notamment la fixation, étape complexe et cruciale, la déshydratation ainsi que sur l’utilisation de fluorochromes pour la détection des protéines afin d’améliorer la précision du signal obtenu. Le microscope confocal et mutiphotonique du laboratoire est équipé d’un système d’analyse spectrale afin de discriminer le signal spécifique de l’autofluorescence (due aux parois cellulaires ou aux nombreux composés phénoliques présents dans les tissus végétaux). Il permet aussi d’obtenir des images en 3D à partir d’organes entiers ou de coupes épaisses.
Enfin ce mode de marquage en fluorescence permet de localiser plusieurs protéines sur la même coupe en utilisant des anticorps d’origine différente ou de nature isotypique différente, couplés à des fluorochromes de couleurs différentes.

Localisation des ARN messagers par hybridation in situ

L’hybridation in situ est une technique puissante utilisée pour visualiser les ARN messagers dans les tissus et les cellules, permettant ainsi une analyse spatiale et temporelle de l’expression des gènes dans les tissus animaux et végétaux. C’est une étape clé de l’analyse fonctionnelle des gènes.
Elle consiste à créer des liaisons hydrogènes entre les bases azotées de la séquence d’un acide nucléique portant un marqueur (une sonde) et la séquence complémentaire présente dans les tissus, générant ainsi un signal détectable au microscope.

Il s’agit d’une technique longue et délicate. La plateforme PHIV possède une longue expérience en hybridation in situ acquise sur une grande diversité d’organes et d’espèces (sur les plantes modèles Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula, Oriza sativa mais aussi sur des espèces tropicales, cacaoyer, palmier, hévéa etc…) et sur différents types de gènes (gènes faiblement exprimés, facteurs de transcription, transporteurs d’ions…)
Les différentes étapes de l’expérience (préparation des échantillons, coupes, synthèse et marquage des sondes, hybridation proprement dite et observations au microscope) sont délicates et difficiles à standardiser. Fort de notre expérience, nous proposons plusieurs protocoles afin de s’adapter aux tissus et aux gènes étudiés dans la plante. Ces adaptations portent autant sur la préparation des échantillons et la synthèse des sondes que sur les conditions d’hybridation et la révélation du signal.