Principe

Confocal: On éclaire la surface non plus par un faisceau de lumière blanche, mais par un rayon laser, concentré par une lentille, qui balaie la surface en positionnant une sténopée (pinhole en anglais) devant le détecteur, dans un plan focal conjugué au plan focal de l’objectif (plans confocaux). De cette manière, seuls les photons provenant du plan focal passent la sténopée et participent à la formation de l’image, d'où le nom « confocal ».
Le balayage par le laser se fait à l’aide de deux miroirs orthogonaux. Les détecteurs utilisés sont des tubes photo-multiplicateurs (PMT), l’intensité lumineuse est mesurée et numérisée en fonction de la position du laser dans l’échantillon : on obtient directement des images numériques.
Les lasers utilisés le plus fréquemment sont les suivants :
* argon-ion (longueurs d'onde : 457nm, 488nm, 514nm)
* hélium-néon (543nm)
* hélium-néon (633nm)

Multiphoton : La faible profondeur de champ est obtenue en n’excitant la fluorescence que dans un volume restreint par excitation multiphotonique à l’aide de lasers pulsés (100 fs) dans l’infrarouge (700-1300 nm). Cette excitation consiste en l'absorption quasi-simultanée de plusieurs photons d'excitation d'une longueur d'onde proche d'un multiple de l'excitation optimale à un photon. La totalité de la fluorescence arrive au niveau du détecteur, il n’y a plus de sténopée.
Avantages : meilleure pénétration dans l’échantillon (jusqu’à 500 µm de profondeur) réduction du photo-dommage cellulaire à la seule région focale, rapport signal/bruit amélioré.

Utilisation

Visualisation des molécules et des activités biologiques in situ.
Imagerie 3D : reconstruction à partir des sections optiques